Molekular­biologische Methoden

HPV-DIAGNOSTIK

Mit Einführung der neuen Krebsfrüherkennungsrichtlinie gelten seit dem 1. Januar 2020 neue Rahmenbedingungen. Durften die Verfahren zur Identifizierung von Hochrisiko (HR)-Human Papillomviren (HPV) zuvor lediglich nur bei auffälligen zytologischen Befunden oder bei Zustand nach operativen Eingriffen am Gebärmutterhals in der Versorgung gesetzlich versicherter anspruchsberechtigter Frauen genutzt werden, so dürfen diese HR-HPV-Tests nun auch im Rahmen des Primärscreenings verwendet werden. Dabei bestehen an den HR-HPV-Test bestimmte Mindestanforderungen.

RT-PCR-HPV-NACHWEIS

Abbildung 1: Formen des Humanen Papillomvirus: Hoch- und Niedrigrisikotypen.
Abbildung 1: Formen des Humanen Papillomvirus: Hoch- und Niedrigrisikotypen.

Die von uns verwendeten HR-HPV-Methoden nutzen die Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Technologie und erfüllen die Vorgaben der neuen Richtlinie.

Diese Methoden nutzen spezifische Gensequenzen für den HPV-Nachweis und ermöglichen es zwischen bestimmten HPV-Genotypen zu unterscheiden. Mittlerweile sind mehr als 220 unterschiedliche HPV-Typen identifiziert, die in Hochrisiko- und Niedrigrisikotypen (HR- und LR-HPV) unterteilt werden. Obwohl die HR-HPV-Infektion einer der Hauptgründe für die Ausbildung eines Zervixkarzinoms ist, sind nicht alle Zervixkarzinome HPV-positiv1.

Der BD Onclarity™ HPV-Test der Firma Becton Dickinson wird auf dem CE-IVDD zertifizierten BD COR™ System ausgeführt. Der HPV-Test weist simultan die 14 geforderten HR-HPV-Genotypen nach. Dabei ermöglicht er sowohl den Nachweis einzelner Genotypen (16, 18, 45, 31, 51 und 52) als auch einen Gruppennachweis (33/58, 56/59/66 und 35/39/68) und deckt damit die wichtigsten krebserregenden HR-HPV-Genotypen ab. Zur Identifikation werden genotypspezifische Primer und Sonden verwendet. Die Zielsequenz für den HPV-Nachweis sind die Proteine E6 und E7. Diese Onkogene tragen zur malignen Progression bei, indem sie durch eine Überexpression eine zunehmende Instabilität des Genoms der Wirtszelle bewirken2. Es sind keine Kreuzreaktivitäten mit LR-HPV-Genotypen bekannt. Der Test hat eine FDA-Zulassung. Detaillierte Informationen zum Testverfahren finden sich hier.

Der Alinity m HR HPV-Test der Firma Abbott Molecular wird auf dem CE-IVDD zertifizierten Alinity m™ System ausgeführt. Der HPV-Test weist ebenfalls simultan die 14 geforderten HR-HPV-Genotypen nach. Dabei ermöglicht er sowohl den Nachweis einzelner Genotypen (16, 18, 45,) als auch einen Gruppennachweis (31/ 33/ 52/ 58 und 35/ 39/ 51/ 56/ 59/ 66/ 68) und deckt damit die wichtigsten krebserregenden HR-HPV-Genotypen ab. Die Zielsequenz für den HPV-Nachweis ist die L1 Region. Bislang sind keine Kreuzreaktivitäten mit LR-HPV-Genotypen bekannt. Detaillierte Informationen zum Testverfahren finden sich hier.

Beide Methoden erfüllen die klinisch-internationalen Richtlinien (Meijer Kriterien) für HPV-Nachweisverfahren3.

1 de Sanjose, S., Quint, W. G., Alemany, L., Geraets, D. T., Klaustermeier, J. E., Lloveras, B., ... & Vallejos, C. S. (2010). Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer: a retrospective cross-sectional worldwide study. The lancet oncology, 11(11), 1048-1056.

2 Doorbar, J. (2006). Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer. Clinical science, 110(5), 525-541.

3 Meijer, C. J., Berkhof, J., Castle, P. E., Hesselink, A. T., Franco, E. L., Ronco, G., ... & Heideman, D. A. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. International journal of cancer, 124(3), 516-520.

Indikationen der HPV Diagnostik

Die seit dem 01. Januar 2020 geltende Krebsfrüherkennungsrichtlinie sieht veränderte Indikationsstellungen und Empfehlungen vor. Zwar haben die Frauen weiterhin erstmalig ab dem Alter von 20 Jahren Anspruch auf die Früherkennungsuntersuchung für den Gebärmutterhals, jedoch unterteilen die neuen bindenden Vorgaben die Gruppe der anspruchsberechtigten Frauen in eine Gruppe Frauen von 20 bis 34 Jahren und eine Gruppe Frauen ab dem Alter von 35 Jahren. Für beide Gruppen gelten unterschiedliche Indikationsstellungen zur Anwendung der HPV-Diagnostik nicht nur im Follow up.

Grafik: Zytologie-Screening für Frauen von 20-34 Jahren

So ist für die Gruppe der Frauen bis 34 Jahren primär eine jährliche zytologiebasierte Früherkennung für den Gebärmutterhals vorgesehen. Die HPV-Diagnostik wird nur bei zytologischen Befunden der Gruppe II-p, II-g oder IIID1 ab dem Alter von 30 bis 34 Jahren mit einem HPV-Test in 6 – 12 Monaten durchgeführt. Hingegen werden zytologische Befunde der Gruppe II-p, II-g oder IIID1 bis zum Alter von 29 Jahren mit einem Pap-Abstrich in 6-12 Monaten kontrolliert.

Grafik: Ko-Testung (HPV und Zytologie) für Frauen ≥ 35 Jahren

Für Frauen ab dem Alter von 35 Jahren ist zunächst eine Ko-Testung bestehend aus zytologischer Untersuchung und HPV-Test im Abstand von drei Kalenderjahren vorgesehen. Im Follow up kommt der HPV-Test nur in bestimmten Befundkonstellationen zum Tragen: Ergibt sich ein Zytologiebefund der Gruppe I und ein positives HPV-Testergebnis bzw. ein Zytologiebefund der Gruppe IIID1 und ein negatives HPV-Testergebnis, soll nach 12 Monaten eine erneute kombinierte Untersuchung (Ko-Testung) stattfinden.

Immunzytochemische Methoden

Immunzytochemische Methoden können in der gynäkologischen Zytologie zur Bewertung und Analyse von unklaren Befunden und von erkannten Dysplasien zur Qualitätskontrolle in der zytologischen Diagnostik verwendet werden. Wir verwenden den CINtec® PlusTest der Firma Roche Diagnostic Deutschland GmbH.

Das duale immunzytochemische Nachweisverfahren kann sowohl auf Basis des konventionellen Pap-Abstrichs als auf Basis der Dünnschichtzytologie durchgeführt werden.

Hierzu muss die Papanicolaou Färbung im Falle eines konventionellen zytologischen Pap-Abstrichs rückgängig gemacht und anschließend dem immunzytochemischen Färbeprozess zugeführt werden.

Da bei der Dünnschichtzytologie in der Regel ein Restvolumen an Zellen in der Transportlösung verbleibt kann diese für das immunzytochemische Nachweisverfahren verwendet werden. Das zweifache immunzytochemische Nachweisverfahren erkennt die körpereigenen Proteine p16-INK4a und Ki-67.

Abbildung 3: p16-INK4a Färbung

Das Zellprotein p16-INK4a übt eine Kontrollfunktion innerhalb der Zellzyklusmechanismen aus und ist unter physiologischen Bedingungen gebunden. Liegt jedoch freies p16-INK4a vor, so kann dies in einen direkten Zusammenhang mit einer Veränderung der Zelle (Transformation) gebracht werden, die z.B. durch eine anhaltende Infektion mit HR-HPV-Typen verursacht wird. Bei einem positiven Nachweis von p16-INK4a färbt sich das Zytoplasma der betroffenen Zelle braun (siehe Abbildung 3).

Abbildung 4: Ki-67 Färbung

Der zweite Schritt verfolgt die Identifizierung des Zellproteins Ki-67. Dieses Protein kann während einer bestimmten Phase des Zellzyklus (Interphase) im Zellkern nachgewiesen werden und wird auch als Biomarker für die Zellproliferation bezeichnet. Sein positiver Nachweis führt zu einer Rotfärbung des Zellkerns (siehe Abbildung 4).

Foto: Abbildung 5: CINtec ® PLUS positiv: Cluster mit dual gefärbten Einzelzellen.
Abbildung 5: CINtec ® PLUS positiv: Cluster mit dual gefärbten Einzelzellen.

Normalerweise, unter physiologischen Bedingungen, kommen beide Proteine nicht gleichzeitig innerhalb einer Zelle vor. Falls jedoch beide Proteine in einer Zelle nachgewiesen werden, so kann dies als Zeichen für eine weiter voranschreitende Läsion gedeutet werden (positives Testergebnis). Falls die Proteine nicht innerhalb einer Zelle nachgewiesen werden, ist das Testergebnis negativ. In diesem Fall ist die Rückbildung der beobachteten Läsion wahrscheinlich.

Nachweis Chlamydia trachomatis und Neisseria gonorrhoeae

Neben der HPV-Diagnostik führen wir auch den Nachweis für weitere sexuell übertragbare Infektionen durch: den Nachweis für Chlamydien und Gonorrhö für alle Arten von Genitalabstrichen basierend auf einer Eisenoxid-, FOX™ Extraktions- und Strang-Verdrängungs-Amplifikations (SDA) - Technologie für die direkte, qualitative Detektion von Chlamydia trachomatis- und Neisseria gonorrhoeae-DNA.

Bei Frauen wird entweder das Untersuchungsmaterial aus Urin oder das Untersuchungsmaterial aus Endozervixabstriche, Vaginalabstrichen analysiert.  Bei Männern können ebenfalls Urinproben oder Urethralabstriche analysiert werden.