HPV Analyser

Molekularbiologische Methoden

Wir verwenden unterschiedliche molekularbiologische Methoden, die uns bei der Differentialdiagnostik und Suche nach Vorstufen des Gebärmutterhalskrebses unterstützen (HPV - und immunzytochemische Nachweismethoden). Der Einsatz dieser Methoden ist nur bei auffälligem Pap-Abstrich oder bei Zustand nach operativem (operativen) Eingriff(en) am Gebärmutterhals wegen CIN I bis CIN III sinnvoll.

Nachweis von Humanen Papillomviren (HPV) mittels cobas ® HPV Test

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Erfassung der Registrierungskanäle des cobas® 4800 HPV Test
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Erfassung der Registrierungskanäle des cobas® 4800 HPV Test

Zum Nachweis von Humanen Papillomaviren kann der cobas® 4800 HPV Test verwendet werden. Mit diese Test kann ein kombinierter und Einzelnachweis von Humanen Papillomaviren über getrennte Registrierungskanäle (1-3) erfolgen. Der Kanal 4 als interne Kontrolle zum Nachweis von menschlichem ß-Globin.
Der Cobas® 4800 HPV Test (Cobas) der Firma Roche Diagnostic Deutschland GmbH kann in einem Schritt den HR-HPV-Typ-16 und den HR-HPV-Typ-18 als Einzelnachweis sowie 12 weitere HR-HPV-Typen (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 und 68) zusammen nachweisen. Er verfügt ebenso wie der hc2-Test über die FDA-Zulassung und ist CE zertifiziert. Dabei dient das humane ß-Globin als intern Kontrolle, da es das Vorhandensein menschlicher DNA in dem untersuchten Zellmaterial bestätigt. Die Nachweisgrenze ab der ein Testwert als positiv betrachtet wird (analytischer Schwellenwert) liegt je nach HPV-Typ zwischen 150–2400 Kopien/ml.

Abbildung 2: Detektion des L1 Proteins
Abbildung 2: Detektion des L1 Proteins

Test Prinzip: Detektion des L1 Proteins

Der cobas® 4800 HPV Test ist auf die Erkennung eines bestimmten Bereich des Humanen Papillomvirus spezialisiert: das Hüllenprotein L1 (siehe Abbildung 2). Diese Zielsequenz bleibt auch bei der Vervielfältigung der Erbinformation des Virus und kann daher als Nachweis dienen.


Nachweis von Humanen Papillomviren (HPV) mittels Hybrid Capture II Test

Hybrid Capture II Test
Abbildung 2: Hybrid Capture 2 Test und klinisch validierte analytische Sensitivität
Abbildung 2: Hybrid Capture 2 Test und klinisch validierte analytische Sensitivität

Der Nachweis von Humanen Papillomaviren kann auf Basis des Hybrid Capture 2 Testes (hc-2 Test, QIAGEN GmbH Str. 1, 40724 Hilden) erfolgen. Er verfügt neben der FDA-Zulassung auch über die CE-Zertifizierung und kann fünf Niedrigrisiko (6, 11, 42, 43, 44) - und dreizehn HR-HPV-DNA Typen (16, 18, 31, 33, 35, 39, 4, 51, 52, 56, 58, 59, 68) nachweisen. Der Nachweise eines einzelnen Virustyps (Genotypisierung) ist nicht möglich. Der hc2-Test ermöglicht über eine Hybridisierung mit anschließender Signalverstärkung den Nachweis von 1pg HPV-DNA pro ml. Dies entspricht einer klinisch validierten analytischen Sensitivität von 5.000 HPV-DNA-Kopien pro Test.

Schritt 1: Freisetzung der DNA aus den Zellen

Schritt 1: Freisetzung der DNA aus den Zellen

In einem ersten Schritt wird die DNA aus den Zellen freigesetzt und denaturiert. Hierzu wird der Probe Alkali zugeführt, damit die Ziel-DNA-Moleküle einzelsträngig und für die Hybridisierung zugänglich werden. Danach wird die DNA mit der RNA-Sonde unter Bindung eines doppelsträngigen RNA-DNA-Hybridkomplexes hybridisiert.

Schritt 2: Erkennen, binden und fixieren der RNA-DNA Hybride

Schritt 2: Erkennen, binden und fixieren der RNA-DNA Hybride

Im Anschluss wird die Probe in einen mit speziellen Antikörpern beschichteten Behälter überführt. Diese Antikörper erkennen spezifisch RNA-DNA-Hybride, binden und fixieren sie auf der Oberfläche des Behälters. Ein zweiter mit einer alkalischen Phosphatase markierter Antikörper erkennt und bindet an den fixierten RNA-DNA-Hybride. Ein Reinigungsprozess sichert, dass nur die fixierten RNA-DNA-Hybride in der Probe verbleiben.

Schritt 3: Analyse der alkalischen Phosphatase durch ein Luminometer

Schritt 3: Analyse der alkalischen Phosphatase durch ein Luminometer

Die Zugabe eines Enzyms spaltet die alkalischen Phosphatase ab. Das dabei freiwerdende Licht wird durch einen Luminometer registriert und dient als Infektionsmarker.


Indikationen der HPV Diagnostik

Bei auffälliger Zervixzytologie oder bei Zustand nach operativem (operativen) Eingriff(en) an der Cervix uteri wegen CIN I bis CIN III übernimmt die GKV die Kosten für den HPV-DNA Test

Indikationen der HPV Diagnostik

Immunzytochemische Methoden

Neben den HPV-Nachweismethoden können in der gynäkologischen Zytologie zur Bewertung und Analyse von unklaren Befunden und zur Bewertung von erkannten Dysplasien des Gebärmutterhalses ebenso wie zur Qualitätskontrolle in der zytologischen Diagnostik immunzytochemische Methoden verwendet werden. Wir verwenden den CINtec® PlusTest der Firma Roche Diagnostic Deutschland GmbH.

Dieses duale immunzytochemische Nachweisverfahren kann sowohl auf Basis des konventionellen Abstrichs als auch auf Basis der Dünnschichtzytologie durchgeführt werden.
Bereits im Labor gefärbte und befundete Pap-Abstriche, können für dieses Nachweisverfahren entfärbt werden. Im Anschluss durchläuft der Pap-Abstrich einen spezialisierten (immunzytochemischen) Färbeprozess.
Bei der Dünnschichtzytologie werden die Zellen erst im Labor aus der Transportlösung nach einem aufwendigen Filterprozess auf den Objektträger übertragen, anschließend gefärbt und bewertet. In der Regel bleibt ein Restvolumen an Zellen in der Transportlösung, die für das immunzytochemische Nachweisverfahren verwendet werden kann. Eine Entfärbung ist dann nicht notwendig. Das zweifache immunzytochemische Nachweisverfahren erkennt die körpereigenen Proteine p16-INK4a und Ki-67.

Abbildung 3: p16-INK4a Färbung
Abbildung 3: p16-INK4a Färbung

Das Zellprotein p16-INK4a hat eine Kontrollfunktion innerhalb des Zellzyklus. Unter physiologischen Bedingungen ist es gebunden. Liegt freies p16-INK4a vor, so kann dies in einen direkten Zusammenhang mit einer Veränderung der Zelle (Transformation) gebracht werden, die z.B. durch eine anhaltende Infektion mit Hochrisiko Humanen Papillomviren verursacht werden kann. Bei einem positiven Nachweis von p16-INK4a färbt sich das Zytoplasma der betroffenen Zelle braun (siehe Abbildung 3).

Abbildung 4: Ki-67 Färbung
Abbildung 4: Ki-67 Färbung

Der zweite Schritt des immunzytochemischen Nachweisverfahrens zielt auf das Zellprotein Ki-67. Dieses Protein kann während einer bestimmten Phase des Zellzyklus (Interphase) im Zellkern nachgewiesen werden und wird auch als Biomarker für die Zellproliferation bezeichnet. Sein positiver Nachweis führt zu einer Rotfärbung des Zellkerns (siehe Abbildung 4).

Abbildung 5: CINtec ® PLUS positiv: Cluster mit dual gefärbten Einzelzellen.
Abbildung 5: CINtec ® PLUS positiv: Cluster mit dual gefärbten Einzelzellen.

Normalerweise, unter physiologischen Bedingungen, kommen beide Proteine nicht innerhalb einer Zelle vor. Falls jedoch beide Proteine in einer Zelle nachgewiesen werden, so kann dies als Zeichen für eine weiter voranschreitende Läsion gedeutet werden (positives Testergebnis). Falls die Proteine nicht innerhalb einer Zelle nachgewiesen werden, ist das Testergebnis negativ. In diesem Fall ist die Rückbildung der beobachteten Läsion wahrscheinlich.

Der gleichzeitige Nachweis der Proteine p16-INK4a und Ki-67 in derselben Zelle ist ein Indikator für die Deregulation des Zellzyklus, in denen der onkogene Transformationsprozess durch HR-HPV begonnen haben kann.

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